Er：YAG激光和Vector超声波系统对钛种植体表面培养的人成骨样细胞生物相容性的影响
Frank Schwarz 发表于2009年9月
【摘 要】 目的 本研究探讨Er：YAG激光（ERL）和Vector超声系统（VS）对钛种植体表面培养的人成骨样细胞SAOS-2生物相容性的影响。采用四种不同表面治疗的168钛圆盘分别（喷砂和酸蚀刻，钛等离子喷涂，机械抛光，和羟基磷灰石涂层）被用来评价细胞附着。把样品随机抽样分配到以下几组：（1）Er：YAG激光在100兆焦耳/脉冲和10赫兹的能量水平使用特殊工作尖组（ERL），（2）使用Vector超声系统的碳纤维工作尖组（VS），或（3）空白对照组（C）。钛圆盘被安置在培养皿中，表面被覆SAOS-2细胞溶液，并培养7天。然后用磷酸盐缓冲液冲洗样本，消除没有贴附在钛表面上的细胞，贴附细胞采HE染色。采用反射光显微镜观察和计算每平方毫米细胞密度。此外，用扫描电子显微镜（SEM）对治疗后的钛圆盘上细胞形态和表面变化进行研究。实验证明所有用ERL处理后的钛圆盘表面的每平方毫米细胞密度与空白对照组（C）者几乎相同。使用Vector超声系统的碳纤维工作尖组（VS）治疗后的种植体表面细胞附着数量有明显减少。扫描电镜观察发现激光照射组和空白对照组（C）的钛表面没有明显的差异。所有使用Vector超声系统的碳纤维工作尖组（VS）治疗后的种植体表面有明显的损伤和碳纤维的碎片。本研究结果表明，（1）ERL不会损害钛金属表面，并且不影响SAOS-2细胞的贴附率，（2）Vector超声系统的碳纤维工作尖，似乎并不适合于钛表面的操作。
【关键词】细胞粘附 人成骨样细胞 激光/治疗应用 超声设备/治疗应用 钛的表面
今天，在临床实践中通过骨内种植体进行口腔修复的方式得到了重视。各种种植体表面有不同的特点，从相对光滑的机械加工表面到更粗糙的表面（如使用涂覆工艺，用不同材料喷砂，酸治疗，或综合工艺治疗）（Cochran 1999）。从动物和体外实验结果所提供明确的证据表明，与光滑表面种植体相比，粗糙表面增加了骨和种植体的接触，破坏骨－种植体结合需要更大的力量（Carlsson et al．1988；Deporter et al．1990）。虽然临床结果在头十年表现出良好的前景，大约10%的骨结合种植体在负载后脱失（Adell et al．1990）。有若干因素与种植体失败的发病机制有关。其中之一是与存在于种植体颈部周围的病原体有关（Mombelli et al．1988；Becker．1990；Alcoforado et al．1991）。病原体可能导致种植体周围粘膜的炎症，如果不及时治疗，炎症将蔓延到根尖周围以及导致骨吸收，这已被命名为种植体周围炎（Mombelli et al．1987；Mombelli & Lang 1994）。因此，治疗的主要目标是彻底清除种植体表面所有的钙化的和细菌性沉积物，以阻止疾病进展。理想的情况下，骨和种植体的接触面应增加，种植体出现新的骨整合。
机械性的和化学性的这两种方法都可清洁和消毒种植体表面（Parham et al．1989；Fox et al．1990；Mombelli & Lang 1992；Ruhling et al．1994；Ericsson et al．1996；Schenk et al．1997；Augthun et al．1998）。使用机械性的清洁方法时，金属刮治器和超声波洁治器会造成种植体表面结构的改变，因此禁忌其使用(Augthun et al．1998；Thomson-Neal et al．1989)。应用塑料刮治器不足以消除粗糙种植体表面的细菌（Fox et al．1990；Augthun et al．1998）。
喷砂可用于种植体表面清洁(Parham et al．1989；Augthun et al．1998)。然而，喷砂的应用是有限制的，因为它们可能增加肺气肿的风险(Van de Velde et al．1991)。使用化学性的清洁方法时，辅助龈下冲洗与局部消毒剂或抗生素治疗种植体周围炎患者是有效的(Mombelli & Lang 1992；Schenk et al．1997)。此外，手术治疗结合全身抗生素也是种植体周围炎的治疗方法(Ericsson et al．1996；Persson et al．1996)。
除了这些常规手段，有研究推荐利用激光设备对种植体表面进行清洁和去污（Oyster et al．1995；Romanos et al．2000；Kreisler et al．2002a，b)。最近公布的研究结果表明，在所有应用激光的牙科领域，只有二氧化碳CO2激光，半导体激光和铒：YAG激光（掺铒钇铝石榴石）激光（ERL）可能用于种植体表面，因为这几种激光照射后，种植体温度增加不显著(Oyster et al．1995；Ando et al．1996；Kato et al．1998；Romanos et al．2000；Kreisler et al．2002a，b)。相比之下，使用Nd：YAG激光（掺钕钇铝石榴石）造成多孔钛表面及其涂层大面积熔化和损害（Pick & Colvard 1993；Romanos et al．2000）。请密切注意ERL的临床适用性波长为近红外光谱的二点九四毫米。该波长能被水很好地吸收，因为波长峰值接近水的吸收系数。最近，ERL被报告为最有前途的牙周治疗用激光（Aoki et al．1994；Ando et al．1996；Folwaczny et al．2001；Schwarz et al．2001a，b；Schwarz et al．2001a）。其出色的烧蚀硬组织和有效去除牙石的能力，以及对邻近组织很少产生热损伤副作用，已在许多研究报告中得到证明（Aoki et al．1994；Folwaczny et al．2001；Schwarz et al．2001a）。
此外，一个临床对照试验结果表明，非手术牙周治疗时使用ERL导致明显的临床附着水平增益（Schwarz et al．2001b）。然而，只有少数报告评估了这种激光对种植体表面特性的影响（Rechmann et al．2000；Kreisler et al．2002a）。在此背景下，ERL的照射效应对钛表面的生物相容性的影响具有重大意义。因此，本研究的目的是探讨ERL的照射同时用特殊的工作尖作用于种植体表面后，对培养的人类成骨样细胞生物相容性的影响，将Vector超声系统（VS）的碳纤维工作尖处理作为阳性对照组，以未经处理的钛种植体表面作为阴性对照组（C）。此外，采用扫描电子显微镜（SEM）对细胞形态和处理后钛圆盘的表面改建进行了研究。
材料和方法
钛圆盘 四种不同类型的测试钛圆盘（10mm直径和2mm厚）来自市售的材料，其纯钛表面的处理模式包括：喷砂和酸蚀刻（SLA），等离子钛喷涂（TPS），机械抛光（MP）（IMZ-TwinPlus，Friadent有限公司，德国Mannheim；ITI，Straumann，瓦尔登堡，瑞士）和羟基磷灰石（HA）涂层（IMZ-TwinPlus，Friadent有限公司，德国曼海姆）。共有168个钛圆盘被随机分配到下列试验组和对照组：（1）ERL（试验组1），（2）Vector超声系统（VS）（试验组2），或（3）未经处理的钛种植体表面组。每一组包含16个SLA，16个TPS，16个MP和8个HA涂层表面处理的钛圆盘。此外，21个钛圆盘被分配到试验和对照组，并准备扫描电镜检查。
处理
选用的ERL激光设备（KEY II，KaVo，Biberach，Germany德国）发射脉冲红外辐射的波长为二点九四毫米。激光参数设定为100兆焦耳/脉冲（12.7J/cm2），10赫兹，而能量脉冲的峰值大约是85兆焦耳/脉冲。细胞形态的差异。激光束是在水冲洗的情况下作用于种植体表面，由一个专门设计的牙周手机（2056，KaVo，Biberach，Germany）和一个锥形玻璃纤维尖端散发出径向和轴向激光束（图1）。照射个别样本前，对实际脉冲能量进行了测量（Filed Mas ter GS，Coherent，Dieburg，Germany）。用专门设计的超声波系统（Vector，Dürr，Bietigheim-Bissingen，Germany）和直形的碳纤维工作尖和抛光液（HA颗粒直径＜10毫米）（图2）对试验组2进行处理。在这两组中，纤维工作尖是遵循平行的表面钛合金在接触模式。每个钛表面只扫描一次，规范的治疗时间。所需的时间，治疗的激光和向量组，平均每钛圆盘2分钟。
细胞培养
钛圆盘被安置在24孔板（Lap Tek Chamber Slide，Nalge Nunc，Naperville，IL，USA），其中接种SAOS-2细胞溶液（ATCC，No．HTB 85，Manassas，VA，USA）（四排，2×104细胞悬浮于2毫升McCoy’s 5A型培养基（Gibco No．21017-025，Life Technologies GmbH，Karlsruhe，Germany）辅以1%青霉素/链霉素和15%胎牛血清，并培养7天。培养条件定为37℃，95%的空气湿度和5%的二氧化碳。培养液每2-3天更换一次。培养后的样本，轻轻地用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，清除未贴附在钛圆盘表面的细胞。最后，贴附细胞用甲醛（3%）固定，HE染色。
显微镜分析
采用反射光显微镜（Leitz Orthoplan，Leitz，Wetzlar，Germany）（放大倍率200倍视野）和计数网格进行细胞计数。随机选取八个视野（约八平方毫米）进行观察和染色细胞计数，所有样品都由两名双盲检测者进行了独立观察。
同一个检测者重复计数两个钛圆盘表面的细胞数（n=14）10次，以评价测量者间信度；两名检测者分析了同一样品表面的细胞计数（n=7），以确定测量者内信度。由此得到变异系数。
扫描电镜观察
经过培养，钛圆盘用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗，以清除未贴附表面的细胞，在室温条件用在0.15M磷酸盐缓冲液（pH值＝7.4）4%戊二醛中固定30分钟，随后用0.15MPBS冲洗15分钟。样本通过梯度浓度的丙酮脱水（从40%到100%，10%的步骤）。用六甲基二甲硅基胺干燥后的样本，黄金溅射包埋涂层后使用SEM观察（Scanning Microscope DSM 950，Zeiss，Germany）。所有样品都由两名双盲检测者进行了独立观察。
统计学分析
统计分析采用SPSS软件11.0软件包（SPSS软件11.0，SPSS软件公司，Chicago，IL，美国）。每个钛圆盘表面每八平方毫米面积内的细胞数量除以8表示每平方毫米细胞密度。然后计算各组均值和标准差。组间进行比较使用Wilcoxon秩和检验，差异显著性水平设为P＜0.05。
结果
细胞数量评估
测量者间可信区间介于1.3%和2.4%之间，低于测量者内可信区间（最高3.1%）。在所有试验组和对照组，SLA处理的表面看到了每平方毫米最多的细胞数量，其次是TPS和MP处理的表面。在HA涂层表面显示最少的每平方毫米细胞密度（图3a-c）。所有用ERL处理的钛圆盘都显示了与未经处理的对照组表面相似的每平方毫米细胞密度（图3a和c）。但是，经VS处理后的种植体表面出现具有统计学意义的细胞数量减少（P＜0.001）（图3b）。在激光处理组和对照组，平均每平方毫米细胞数量明显高于VS处理组（P＜0.001）。激光处理组和对照组比较无显著差异（P＞0.05）。
表面状态和细胞形态
扫描电镜检查激光处理组和对照组的钛表面没有显示明显的形态差异。在激光处理组，没有出现热损伤副作用，也没有出现诸如熔化或多孔结构的破坏（图4-7：a，b）。然而，所有用VS处理的钛表面出现明显的突起（擦伤）和碳纤维残片（图4-7：c）。在用MP处理的钛表面，细胞开始伸展，钛表面出现完全的胞体胞质的伸展。细胞朝平行于钛表面的线性沟槽方向分布（图4a-c）。在SLA和TPS钛金属表面，细胞聚集成纺锤形。尽管钛表面形态普遍有点不规则，但是细胞体还是普遍铺满沟槽和凹坑，细胞分布没有表现出任何方向性（图5和6:a-c）。与此相反，在HA涂层表面的细胞表现出异质性，有光滑的圆形轮廓的，有的表现和TPS表面的细胞一样，有的像成簇的完全融化或未融化小颗粒。细胞普遍呈圆形并贴附在所有区域（图7a-c）。没有观察到试验组和对照组之间向和轴向的激光束。图3：评估培养7天内的成骨样细胞悬液，分析在不同种植体表面的细胞密度的中位数和Q1-Q3四分位数的柱形图（cells/mm2），（SLA＝喷砂和酸蚀刻；TPS＝等离子钛喷涂；MP＝机械抛光；HA＝羟基磷灰石涂层；F＝Friadent；S＝Straumann）。柱形图下方和上方的线段＝最小值，最大值。（a）Er：YAG激光；（b）Vector超声波系统；（c）未经处理的对照组表面。
讨论
(P＜0.001)。在本研究中，对ERL或VS处理过的种植体表面，人成骨样SAOS-2细胞表现出不同的反应。所有激光处理后的钛圆盘表面显示每平方毫米细胞密度与对照组（C）者几乎相同，使用Vector超声系统的碳纤维工作尖组（VS）处理后的种植体表面每平方毫米细胞密度减少，差异有统计学意义（P＜0.001）。没有观察到试验组和对照C形态的差异。此外，分析结果表明，在试验组和对照组的SLA处理的表面，每平方毫米贴附的细胞数量最多，其次是TPS和MP处理的表面。在HA涂层表面显示每平方毫米细胞密度最小。这些研究结果与以往的研究是一致的，与在规则表面上相比，不规则的喷砂表面上的贴附细胞数量显著增加（Bowers et al．1992；Martin et al．1995）。由于羟基磷灰石涂层被认为是粗糙表面，重要的是意味着要讨论以前研究结果的可能的生物学解释，为什么羟基磷灰石涂层钛圆盘表面每平方毫米细胞密度最小。以前的研究者注意到羟基磷灰石涂层在生理条件下的溶解（Gross et al．1997）。似乎在HA涂层的种植体表面的细胞较少，这可能反映了HA涂层表面缺乏稳定性（Anselme等，1997年）。在这方面，不能忽视在何种程度上细胞培养液可能导致羟基磷灰石涂层的溶解，并在其后减少了细胞附着于HA表面。（Brunette 1988）。在此背景下，必须提出局限于体外生物活性陶瓷的研究时，如羟基磷灰石涂层容易通过单一沉浸在水溶液（如细胞培养液或生理盐水）中而发生改建的问题。
材料的表面形态对细胞粘附力有重要影响（Inoue et al．1987；Brunette 1988）。质感粗糙或多孔表面能够促进细胞附着。研究表明，粗糙的表面能附着更多的成骨样细胞，更好地促进矿化，而成纤维细胞更喜好光滑或细质感表面（Bowers et al．1992；Kononen et al．1992；Martin et al．1995）。实验中我们使用的细胞附着研究方法类似于以前的研究者比较细胞对不同的种植体表面特性的反应的技术（Bowers et al．1992；Chang et al．1999）。在本研究中，我们使用人成骨肉瘤衍生SAOS-2细胞，其已被定性为成骨样细胞（Murray et al．1987；Rodan et al．1987）。然而，转化细胞系有其自身的局限性，因为一些细胞特性不同于原代细胞。然而，在长期的体外矿化的研究中发现，正常的人成骨培养发生了类似种植体表面SAOS-2细胞的反应，但大约有三分之二的细胞钙化不足（Ahmad et al．1999）。
结果本次研究还表明，ERL处理配合使用特殊工作尖，不会损坏钛表面。到目前为止，只有很少的数据说明ERL处理后对不同的涂层钛圆盘的表面特性产生影响（Rechmann et al．2000；Kreisler et al．2002a）。在最近一份Kreisler等人2002年的研究报告了表面结构的改建，如熔化和玻璃化，在TPS表面能量密度为8.9J/cm2，在SLA表面能量密度为11.2J/cm2，在HA涂层表面能量密度为17.8J/cm2，在光滑的钛金属表面能量密度为28J/cm2。激光采用非接触式模式，没有冷却水，照射角度是90°。在一个类似的研究中，最初的微观形态变化发生在SLA和TPS钛金属表面时的平均能量密度为7J/cm2（Rechmann等. 2000年）。然而，在本研究中没有发现能量密度为12.7J/cm2时任何一种模式的金属表面发生改建。产生这种差异的可能原因是纤维的尖端的接触模式，持续性水冷却并平行于钛表面。在此背景下，重要的是要指出，先前的研究的结果表明，治疗牙周病时使用ERL照射清除大量的根面物质，工作尖的角度是具有重要影响力的因素（Folwaczny等，2001）。此外，还应当指出的是持续性水冷却时产生的损害可能比照射时不用水冲洗少。激光和金属表面之间的相互作用主要取决于对激光吸收和反射的程度。每种金属具有一定的光谱反射能力，这决定于激光的特定波长。其波长为2940nm的近红外光谱时，钛对ERL的反射能力是71%，而在10000nm的CO2激光时钛的反射能力上升高达96%（Lide 2002）。在这种情况下，种植体表面不吸收辐射，也没有继发性温度升高，而这种温度升高将损伤种植体表面。
如上所述，根据已有的报告，ERL是最有前途的牙周激光治疗方法（Ando et al．1996；Folwaczny et al．2002）。此外，在体外研究中提供了ERL照射抗牙周病原菌效果的明确证据（Ando et al．1996；Folwaczny et al．2002）。在此背景下，重要的是要指出以前的研究表明，牙种植体周围的细菌感染类似于牙周疾病（Mombelli et al．1987；Lang et al．1993）。就我们所知，没有任何其他关于VS超声波系统对种植体影响的研究数据。Vector处理组细胞数减少的一个可能的解释为可能是所用的碳纤维碎片的细胞毒作用。然而，必须指出本研究的一个局限性，是缺乏由已知参与种植体周围炎进程的细菌沉积物感染的钛圆盘。因此，无法测试清除表面细菌后，这两种治疗设备对细胞附着率可能的影响。然而，本研究目的不是模拟治疗种植体周围炎，而是研究ERL和VS系统对培养的人类成骨样细胞在不同的种植体涂层上的生物相容性的影响。
另一方面，如上所述，以前的研究表明，不增加激光治疗，其他形式的治疗（如手术治疗结合全身使用抗生素）也已证明是成功的。因此，需要进一步的体内实验模型的对照性研究来表明，ERL照射后模拟治疗种植体周围炎和重新骨整合的过程中，没有发生种植体的损害。
总之，尽管有其局限性，目前的体外实验研究还是表明，ERL照射后使用特殊工作尖，不会损坏钛表面，也不影响人成骨样细胞的新附着率。
